Возникновение Митрофаниевского кладбища связано с эпидемией холеры, разразившейся в Петербурге летом 1831 г. Почти за год до этого, когда болезнь впервые появилась в южных пределах России, в столице был образован специальный медицинский совет, который занялся разработкой мер по борьбе с надвигающимся бедствием. Распространения заразы опасались не только от больных, но и от умерших, поэтому священникам всех приходских церквей были сообщены специальные правила погребения. Места для них велено было отводить отдельно от городских кладбищ, их огораживали, и доступ к ним запрещался. Холерные кладбища подчинялись не церкви, как все остальные, а городской полиции, которая сама записывала погребаемых. Священников на таких кладбищах, как правило, не было, отпеваний и панихид не совершалось. Как писали в то время, «от болезни холеры многие умерли без надлежащего напутствования в жизнь вечную».
Одно из холерных кладбищ появилось на южной окраине Петербурга, близ деревни Тентелевка. После окончания эпидемии мещанка Феврония Комаровская, похоронившая здесь своих родных, стала хлопотать о постройке церкви и собирать для этого средства. В 1835 г. митрополит Серафим благословил это начинание, а власти разрешили «учредить в смежности с холерным обыкновенное городское кладбище». Прошло всего пять месяцев, и небольшая деревянная церковь была освящена во имя новопрославленного святого Митрофана Воронежского. Такая быстрота объяснялась тем, что на кладбище перенесли старую церковь Измайловского полка, для которого был освящен новый величественный Троицкий собор.
Первым церковным старостой стал известный табачный фабрикант В. Г. Жуков. На свои средства он проложил к кладбищу дорогу, обсадил ее ветлами и выстроил ограду.
16 ноября 1841 г. в храме был освящен придел во имя иконы Божией Матери Неопалимая Купина.
